关于TMT/iTRAQ和DIA技术的选择？

我们知道，TMT/iTRAQ子离子标记定量和DIA非标定量是目前蛋白质组最常用的两项技术。一般而言，小样本量，如10样本以上的项目推荐采用TMT/iTRAQ；大样本量的项目推荐采用DIA。为什么呢？

DIA技术因为全采模式被吹上了天，其实应用并没有传说中那么广，只能说是趋势。DIA绝非万能，技术的选择要视情况而定。

首先要明白DIA的优势是在稳定性和覆盖度上。小样本量的实验，比如9个样：对照组、处理组1、处理组2，每组3个生物学重复，DIA的稳定性没有发挥空间。DIA则通常不做分级（成本、数据处理等因素考量），例如对于常规动物组织样本，一般大约定量到6000个蛋白左右，覆盖度的优势也没体现出来。而TMT可通过大量的分级（fractionation），显著提升定量蛋白的数量，同样的常规动物组织样本，TMT通过大量的分级，可定量多至8000+个蛋白的水平。

此外，DIA的实验流程比较复杂，需先建一个图谱library。在样本数量少的情况下，先花机时完成libirary构建，再花机时进行样本的DIA检测。反而不如一次性做TMT来得经济、快捷。

假如你有30个样本，用TMT-11plex，1个plex最多混11个样本，至少也得做3个plex。而且，通常为了提高数据量，每个plex还会做大量的分级，最终会有非常多的上机。关键在于，在这种情况下，多个批次的plex是分别上机检测的，这就会在实验的平行性、稳定性上造成问题。甚至可能做出多批plex的数据，由实验本身导致的各批plex之间的差异性，能完全掩盖实验组别之间的差异。所以，在大量样本上机的情况下，DIA的稳定性优势尽显无疑。

绝大多数采用常规蛋白质组技术的血液研究，都是先利用亲和等方法将血液中高丰度蛋白（白蛋白、IgG等）去除掉，再做蛋白组分析。因为常规蛋白质组受到高丰度信号的影响非常严重。如果不预先去除高丰度蛋白，获得的结果中大量的数据都是大家所不关注的高丰度蛋白的数据，有意义的数据非常少。

而DIA的全扫描模式，受高丰度蛋白影响很小，目前DIA发表的血液蛋白质组研究均不去除高丰度蛋白，不仅获得的数据量不亚于常规蛋白质组的做法，并且其好处是：（1）不用担心高丰度蛋白去除时带走了其他蛋白，造成结果失真；（2）不用担心高丰度蛋白去除操作，引入的平行性隐患；（3）不用担心去除高丰度蛋白实验涉及的实验成本、时间等问题。第二、三点在大规模样本的分析中是重要的考量因素。

为什么要建library？ 质谱对蛋白质肽段的鉴定，基于一级信号及其二级图谱，在常规蛋白质组的扫描模式下，1张二级图谱几乎仅来自于1个一级信号；而在DIA的扫描模式下，1张二级图谱是一个混合图谱，来自于多个的一级信号，其高度复杂。导致常规蛋白质组搜索理论图谱就行了；而DIA的太复杂，要搜实际质谱采集到的图谱，即library（也有不构建library的做法，但准确性、匹配效率效果影响较大）。

library是不是越大越好？ 将谱图库扩容，是不是做大量的分级就行了。实际情况是，通过分级将library的库容提升到一定程度时，其对提高最终的鉴定数量不会再有显著贡献。所以不建议盲目地做大量的分级。要真正提高library的库容，除了分级，比较重要的就是样本的积累：即不断有不同实验来源、不同生物学背景的新样本的library加入。在这点上，越早开展DIA分析、样本和项目数量积累越多的平台，越有优势。

library匹配算法选择？ 解析DIA的复杂数据是关键。Spectronaut/skyline/openSWATH.......

色谱考察和校正 。色谱的峰形、色谱的数据数量点、色谱的稳定性，都直接决定定量准不准；另外，色谱的capacity能力，决定质谱的采集效率。在此基础上，在DIA的大量样本的分离采集过程中，色谱的效果不可避免会波动和下降。所以，不仅要考察色谱的效果，还需要对色谱进行校正（例如掺入iRT内标肽）。

搜库匹配可信度评价 。不同软件给出的判别指标不同。

QC样本评价 。QC样本是用于整体评价数据的最有效方法。QC样本通常是将多个实验样本进行混合，再分为同样的多份。上样时隔一定数量的样本，掺入1份QC样本。因此，最终整个上机过程中会有多个相同的QC样本贯穿其中。假设整个采集过程是稳定的、平行的，那QC样本的数据也应基本一致。最终，我们利用定量偏差（CV值）、主成分分析、相关性等方法，对QC样本的一致性进行评价，以反映整个数据采集过程中的稳定与平行。

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